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          【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制

          日期: 2019-03-27
          浏?#26469;?#25968;: 25

          1.伊曲康唑(ITZ)和25-羟基胆固醇(25-HC)显著降低了非洲猪瘟病毒的复制。(本篇主要内容)


          2.本研究揭示了羟甾醇结合蛋白(OSBP)在未感染非洲猪瘟病毒的Vero细胞膜中的分布,以及在感染细胞的病毒工厂(VFs)周围的分布。


          3.本研究中发现,在非洲猪瘟病毒感染的情况下,羟甾醇结合蛋白(OSBP)和OSBP相关蛋白、PI4K和ACBD3被招募到病毒工厂(VFs)。


          2019年2月26日,西班牙国家农业和食品研究与技术研究所生物技术部Inmaculada Galindo等学者在viruses上发表了题为Lipid Exchange Factors at Membrane Contact Sites in African Swine Fever Virus Infection的文章。


          文章信息如下:


          【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制


          非洲猪瘟病毒(ASFV)引起一?#25191;?#26579;性疾病,感染野猪和家猪。非洲猪瘟(ASF)导致养猪业?#29616;?#30340;经济损失,这是由于该病的死亡率高,并且在缺乏?#34892;?#30123;苗的情况下难以控制该病。


          非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病?#31350;?#23478;族的唯一成员。它是一种二十面体形态的包膜病毒,平均?#26412;?00纳米。基因组结构由一个末端反向重复的线性双链DNA和发夹环组成。非洲猪瘟病毒基因组的长度为170-190kbp,编码范围为151-167个开放阅读框(ORFs)。其复制周期主要在细胞质。?#27426;?#23427;需要在细胞核进行早期病毒DNA合成。


          非洲猪瘟病毒感染周期开始于病毒的吸附,通过结合一种未知的特异性受体(介导内吞作用)进入宿主细胞。


          一旦病毒DNA被释放到细胞质中,它就会聚集到靠近微管组织?#34892;模∕TOC)的核周区域。新病毒的复制和装配发生在复制站点或“病毒工厂”。新的子代病毒离开工厂,被运送到细胞表面,在那里它们通过芽孢释放。与其他病毒相似,为了扩增其基因组,非洲猪瘟病毒重组细胞内膜,在细胞质中生成复制细胞器(ROS)或病毒工厂(VFS)。尽管它们与病毒复制相关,但病毒工厂形成的机制和相关分子仍然未知。最近的科学证据表明,脂类是几种病毒感染?#34892;?#25104;病毒工厂的基础。


          伊曲康唑(ITZ)是一种以甾醇转运分子如羟甾醇结合蛋白(OSBP)和OSBP相关蛋白4(orp4)为靶点的抗真菌药物。


          25-羟基胆固醇(25-HC)通过高亲和力结合羟甾醇结合蛋白(OSBP)来抑制脂?#39318;?#36816;。


          本研究中使用细胞适应性BA71V分离株,分析了在Vero细胞培养中伊曲康唑(ITZ)和25-羟基胆固醇(25-HC)的抗非洲猪瘟病毒作用。


          结果发现伊曲康唑(ITZ)和25-羟基胆固醇(25-HC)显著降低了非洲猪瘟病毒的复制。


          实验数据


          我们推测ITZ可能干扰OSBP在胆固醇转运到非洲猪瘟病毒复制位点的功能。用流式细胞术检测16 hpi时GFP和p72蛋白的表达,以测定该化合物对感染性的影响。


          表达GFP的细胞,被融合到早期病毒p30蛋白的启动子上表达GFP的重组病毒感染,数量略有减少。?#27426;?#25233;制剂显著影响晚期p72蛋白的表达。


          与对照细胞相比,ITZ引起表达晚期p72蛋白的细胞数?#24247;?#21058;量?#35272;?#24615;减少,在100μm浓度下达到约65%的抑制。该结果与溶剂二甲基亚砜处理的对照组进行了比较(图3A)。


          为了证实抑制非洲猪瘟病毒感染的效应或ITZ与OSBP有关,受感染的细胞用25-HC预处理,25-HC是OSBP的一种高亲和力配体,可抑制OSBP介导的胆固醇转移。我们发现了类似的结果,如图3B所示。添加25-HC显著减少了约70%的非洲猪瘟病毒感染,其效果在感染后期更加显著。


          随后我们评估了其他感染参数。病毒蛋白的表达通过受感染的Vero细胞提取物的Western blotting分析,病毒DNA复制的实时荧光定量PCR分析,均在16 hpi。与用二甲基亚砜处理的细胞相比,用ITZ处理的细胞中的病毒蛋白产生量p30和p72减少(图4A)。正如预期的那样,其他感染参数均减少(图4B),病毒滴度降低约1 log(图4C)。


          【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制

          图3 伊曲康唑(ITZ)和25-羟基胆固醇(25-HC)抑制剂对非洲猪瘟病毒感染的影响


          用(A)伊曲康唑(ITZ)或(B)25-羟基胆固醇(25-HC)预处理Vero细胞,用Ba71V或Bp30GFP感染16hpi。用流式细胞仪检测感染细胞,用溶剂二甲基亚砜或乙醇处理的细胞来进行百分?#32570;?#20934;化。误差线表示为三个独立实验的标?#30142;睢?#32479;计显著性差异用星号表示(*** p < 0.001, ** p < 0.01; * p < 0.05)。


          【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制

          图4 (A) western blot实验显示伊曲康唑(ITZ)处理降低了BA71V感染后病毒蛋白表达。(B) 实时荧光定量PCR实验显示非洲猪瘟病毒基因组?#22870;?#25968;减少(C)在BA71V感染Vero细胞24 hpi时,通过菌斑分析伊曲康唑(ITZ)对病毒滴度的影响。误差线显示三个独立实验的标?#30142;睢?#32479;计显著性差异用星号表示(***p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01)。


          我们发现ITZ处理降低了非洲猪瘟病毒感染性和病毒复制。ITZ几乎不影响GFP阳性的感染细胞,但显著降低了晚期p72蛋白的表达。由于GFP在早期蛋白p30启动子的控制下表达,这些结果表明,ITZ不影响病毒进入或早期基因表达。我们的研究结果表明,与其他病毒性疾病类似,这?#20013;?#24212;可能是由于向病毒复制部位供应的脂质减少所致


          最近的一项研究表明,ITZ通过靶向氧甾醇结合蛋白(OSBP)和OSBP相关蛋白4(ORP4)来抑制肠道病毒和丙型肝炎(HCV)的复制。ITZ与OSBP的直接结合,定位于病毒复制细胞器,破坏其脂?#39318;?#36816;功能,这就可以解释ITZ的抗病毒作用。


          为了验证OSBP是非洲猪瘟病毒感染的相关靶点,用25-HC预处理感染细胞。25-HC与OSBP结合,具有很高的亲和力,可作为OSBP胆固醇转移的抑制剂。我们发现25-HC也能显著抑制非洲猪瘟病毒感染。


          这些结果以及胆固醇对非洲猪瘟病毒产生感染性至关重要的?#29575;?#34920;明,在这种特定情况下,ITZ和25-HC的抗病毒活性可能是由于阻断了胆固醇通向病毒工厂的通路,这意味着非洲猪瘟病毒?#32454;褚览?#20110;这些脂质供应进行复制。一直以来,我们发现使用ITZ可以减少病毒工厂周围的胆固醇积累。?#27426;琁TZ不影响与脂?#39318;?#36816;相关的其他蛋白在膜接触位点的表达或定位,如ACBD3、PI4K。


          本研究显示,ITZ和25-HC降低了非洲猪瘟病毒的复制,但没有完全阻止病毒周期的进展。


          本文由胡鹏飞、周盼伊编译整理,本栏目由周盼伊统筹策划


          【研究进展】栏目由《中国动物保健》杂志社兽医学?#38774;?#32452;精心打造,目前已进行了禽流感、新城疫、猪圆环病毒病、猪蓝耳病、猪伪狂犬、非洲猪瘟、猪流感等多个议题的梳理,将陆续发布。


          资料来源:本文图片及内容转自中国动物保健公众号,如有侵权,请联系删除。


          【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制






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